摘要：戊二醛， 分子式為C5H8O2，帶有刺激性氣味的無色透明油狀液體，溶于熱水。用作殺菌劑，也用于皮革鞣制。對(duì)眼睛、皮膚和粘膜有強(qiáng)烈的刺激作用。

建立了一種測定血紅蛋白氧載體中戊二醛殘余含量的高效液相色譜方法。用10kDa超濾膜通過離心3000r/min×20min將游離戊二醛從待測樣品中分離;在pH1.0時(shí)，在含有70%乙腈的體系中用2，4?二硝基苯肼在30min內(nèi)將戊二醛衍生成2,4?二硝基苯腙(n(2,4?二硝基苯肼)∶n(戊二醛)=60∶1)，以70%乙腈為流動(dòng)相，避免了衍生產(chǎn)物生成沉淀。用高效液相色譜法分離測定衍生物，可在20min內(nèi)完成分離，同時(shí)對(duì)衍生步驟進(jìn)行了優(yōu)化。本方法具有較高的靈敏度和良好的線性關(guān)系，檢出限為1.0ng，在0.1～10mg/L范圍內(nèi)其線性相關(guān)系數(shù)為0.9999，重復(fù)測定6次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%，回收率為95.26%。

【關(guān)鍵詞】戊二醛,高效液相色譜,血紅蛋白氧載體,2,4?二硝基苯肼

1引言

血紅蛋白氧載體(Hemoglobin?basedoxygencarriers，HBOCs)是血液替代品中熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一[1,2]。其常用的一種制備方法是以多醛基分子為交聯(lián)劑，如戊二醛，開環(huán)棉籽糖等將血紅蛋白交聯(lián)制備而成[3，4]。游離的戊二醛有一定的毒性，在臨床使用前必須除去。

檢測醛類氣相色譜[5～7]具有較高的分析速度，但是靈敏度相對(duì)較低[8]。高效液相色譜被廣泛應(yīng)用于醛的測定[9～11]，在測定戊二醛時(shí)，顯示出更高的靈敏度[8]。

在液相色譜法中，2,4?二硝基苯肼(2,4?dinitrophenylhydrazine,DNPH)柱前衍生法是測定醛基的強(qiáng)有力的工具之一。文獻(xiàn)報(bào)道大多是測定空氣中戊二醛的污染，未見測定血紅蛋白氧載體中戊二醛的報(bào)道。《中國生物制品規(guī)程》中測定無細(xì)胞百日咳、白喉、破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗中戊二醛的方法[12]不能直接用于血紅蛋白氧載體中戊二醛的測定，需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)處理，且線性關(guān)系較差。因此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)測定血紅蛋白氧載體中殘留戊二醛的方法進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，包括SCL?10Avp控制器，SPD?10Avp檢測器，LC?10Atvp雙泵，DGU?10A脫氣系統(tǒng)，CTO?10Asvp柱溫箱，Class?vp工作站;CBN8?30恒溫水浴(丹麥Heto公司)。5804R離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，10kDa超濾膜(美國Millipore公司)，SigoTCI?Ⅱ恒流泵(北京思路高公司)，KL?UP?Ⅱ20超純水機(jī)(臺(tái)灣艾柯公司)。2,4?二硝基苯肼(98%)、HClO4、25%戊二醛(w/w)購自Sigma公司，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱取2.3760gDNPH，用20%HClO4溶解并定容至100mL,配制成濃度為120mmol/L的貯備液，用20%HClO4稀釋至30mmol/L作為工作液。

2.2.2無基質(zhì)血紅蛋白(Stroma?freehemoglobin,SFH)的制備SFH的制備程序參見文獻(xiàn)[13]的方法。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線將戊二醛分別稀釋成0.1，0.5，1，2，4，6，8和10mg/L，分別取0.5mL于5mL離心管中，加入1.4mL乙腈，再加入0.1mL120mmol/LDNPH，立即于混旋器上混合均勻，反應(yīng)30min后，用有機(jī)濾膜過濾后，上樣20μL進(jìn)行分析。

2.2.4血紅蛋白的聚合過程中戊二醛的測定血紅蛋白的聚合參考文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行，取80g/LSFH50mL，用恒流泵逐滴加入適量的戊二醛(n(SFH)∶n(戊二醛)=1∶10)，待滴加完畢，聚合反應(yīng)4h后，加入1.0mol/L甘氨酸(終濃度0.1mmol/L)進(jìn)行終止，1h后，加入還原劑二甲胺基硼烷(DMAB)進(jìn)行還原(n(戊二醛)∶n(DMAB)=1∶6)，反應(yīng)1h后，用Ringer′s液作為透析液透析24h，每6h換液一次，共換液4次。4℃保存15d，各取5.0mL加入到2個(gè)超濾膜(10kDa，Millipore)中[15]，在4℃以3000r/min離心20min，取下層液體0.5mL,按2.2.3步驟進(jìn)行衍生并測定。

2.3色譜條件

Shim?packVP?ODS色譜柱(250mm×4.6mmi.d.,5μm，孔徑12nm,日本Shimadzu公司);流動(dòng)相：70%乙腈，流速1.0mL/min;檢測波長：360nm。

3結(jié)果與討論

3.1目標(biāo)產(chǎn)物的確定

戊二醛有2個(gè)醛基，與DNPH反應(yīng)后生成的DNPH?one有3種可能的異構(gòu)體：順?順、順?反、反?反異構(gòu)體。圖1為標(biāo)準(zhǔn)戊二醛衍生后的色譜圖。圖1在乙腈體系中衍生的2,4?二硝基苯腙的色譜圖

Fig.1Chromatogramof2,4?dinitrophenylhydrazine(DNPH)?ones.Themobilephaseis70%acetonitrile

峰(peak)1.過量的DNPH(ExcessDNPHreagent);峰(peak)2,3.DNPH?ones異構(gòu)體(DNPH?oneisomer).有2個(gè)明顯的目標(biāo)峰(峰2與3)，應(yīng)該為DNPH?one的其中兩種異構(gòu)體，具體為哪一種異構(gòu)體還有待于進(jìn)一步鑒定，第3種異構(gòu)體沒有觀測到的原因可能是由于異構(gòu)體之間結(jié)構(gòu)非常相似，第3種異構(gòu)體保留時(shí)間和另外兩種異構(gòu)體的其中一種相同，也可能是第3種異構(gòu)體的含量特別少，很難觀測到。在一定范圍內(nèi)用不同濃度的反應(yīng)物進(jìn)行分析，該峰2和峰3的峰面積都和戊二醛濃度之間有良好的線性關(guān)系，都可用于定量研究。分析化學(xué)第37卷第10期嚴(yán)坤平等：高效液相色譜法測定血紅蛋白氧載體中殘留的戊二醛

3.2色譜條件的優(yōu)化

在酸性情況下，用過量的DNPH充分和醛基反應(yīng)，此反應(yīng)的產(chǎn)物2,4?二硝基苯腙在水中的溶解度較小，而在乙腈中的溶解度較大，圖2在50%乙腈體系中進(jìn)行衍生的2，4?二硝基苯腙樣品過濾前(a)后(b)色譜圖對(duì)比

色譜條件和圖1相同(OtherconditionsarethesameasdescribedinFig.1).峰(peak)1.過量的DNPH(ExcessDNPHreagent);峰(peak)2，3.DNPH?ones異構(gòu)體(DNPH?oneisomer)。直接在水中反應(yīng)或在乙腈比例較小時(shí)會(huì)使生成的產(chǎn)物產(chǎn)生沉淀。將6.0mg/L戊二醛在50%乙腈水溶液中衍生，產(chǎn)物用70%乙腈進(jìn)行分離，如圖2a所示，可以看出2，4?二硝基苯腙的色譜峰有明顯的拖尾，而將產(chǎn)物過濾后上樣(圖2b)，則色譜峰無拖尾現(xiàn)象，這說明拖尾是由于沉淀在吸附在色譜柱上，隨流動(dòng)相中重新溶解后再被洗脫下來的緣故。而若將6.0mg/L戊二醛在70%乙腈水溶液中衍生，產(chǎn)物仍用70%乙腈進(jìn)行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物過濾和不過濾譜圖結(jié)果完全相同，都無拖尾現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，戊二醛濃度達(dá)到10.0mg/L時(shí)，在70%乙腈水溶液中衍生不會(huì)產(chǎn)生沉淀。本實(shí)驗(yàn)室采用文獻(xiàn)[12]的方法測定血紅蛋白氧載體中的戊二醛時(shí)，發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系較差，這就是由于采用的乙腈濃度太低，在衍生較高濃度的戊二醛(>6.0mg/L)時(shí)就會(huì)有沉淀產(chǎn)生，沉淀被過濾后導(dǎo)致定量分析不準(zhǔn)確。因此，衍生反應(yīng)應(yīng)該在乙腈比例較高的溶液中進(jìn)行，而且盡可能和流動(dòng)相比較接近，在70%乙腈溶液中進(jìn)行衍生可滿足10.0mg/L以下戊二醛的衍生。流動(dòng)相中乙腈的比例越大，衍生物洗脫時(shí)間就越短，峰形更為尖銳，相應(yīng)的靈敏度也越高，但是，洗脫時(shí)間太短，過量DNPH及雜質(zhì)的洗脫峰會(huì)干擾衍生物的洗脫峰，綜合考慮，以70%乙腈溶液為流動(dòng)相較好。

3.3衍生條件的優(yōu)化

在優(yōu)化衍生條件的實(shí)驗(yàn)中，全部采用1.0mg/L戊二醛為分析物濃度，峰面積以最靈敏的峰3計(jì)算。

3.3.1DNPH和戊二醛的摩爾比DNPH和戊二醛反應(yīng)生成希夫堿，該反應(yīng)不能進(jìn)行完全，因此通常采用過量的DNPH對(duì)戊二醛進(jìn)行衍生，盡可能將戊二醛定量轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的腙。本實(shí)驗(yàn)在n(DNPH)∶n(戊二醛)為2∶1～120∶1的范圍內(nèi)研究了戊二醛的衍生反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明，在70%乙腈，pH=1.0,在20℃反應(yīng)30min的條件下，隨著DNPH濃度的增大，衍生物的轉(zhuǎn)化率也逐漸增大，當(dāng)n(DNPH)∶n(戊二醛)≥60∶1時(shí)，轉(zhuǎn)化率基本保持不變，此條件可以作為定量分析的條件。本實(shí)驗(yàn)采用n(DNPH)∶n(戊二醛)=60∶1進(jìn)行衍生。

3.3.2pH值在乙腈中，HClO4比HCl的溶解性更好[16]，因此，本實(shí)驗(yàn)采用HClO4調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的酸度。為了操作和計(jì)算方便，近似認(rèn)為[H ]≈[HClO4]。本實(shí)驗(yàn)在上述條件下改變pH值，研究了pH值對(duì)衍生反應(yīng)的影響。如圖3所示，pH1.0時(shí)，戊二醛的衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化率最高。

圖3pH對(duì)衍生效率的影響

Fig.3EffectsofpHofmediumonconversionefficiencyofglutaraldehydetoitsDNPH?onesn(DNPH)∶n(戊二醛，glutaraldehyde)=60∶13.2.3反應(yīng)溫度分別在0，10，20和30℃的條件下研究了溫度對(duì)衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果各溫度下衍生物的峰面積分別為166702，184363，187247，180590，除在0℃下面積略小外，其余溫度下的面積均非常接近，說明在10～30℃的范圍內(nèi)反應(yīng)基本不受溫度影響。因此，本實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。

3.2.4反應(yīng)時(shí)間在80min內(nèi)研究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)化效率逐漸增大，在反應(yīng)20min后，衍生反應(yīng)達(dá)到平衡，衍生產(chǎn)物的濃度基本保持不變。為保證本方法的耐用性，衍生時(shí)間選擇30min。

3.3工作曲線、檢測限和精密度

戊二醛濃度在0.1～10mg/L范圍內(nèi)與單峰面積呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=109306x-7405.1，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9999，而如果采用文獻(xiàn)[12]的方法，r<0.99。逐級(jí)稀釋樣品，進(jìn)樣20μL，當(dāng)信噪比為3時(shí)，戊二醛所對(duì)應(yīng)的濃度為0.05mg/L，即檢出限為1.0ng。以1.0mg/L戊二醛進(jìn)行衍生，平行6份，每份樣品各測定一次，每次進(jìn)樣20μL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.0%。

3.4標(biāo)準(zhǔn)加入的回收率

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定回收率。各取終產(chǎn)品5.0mL，分別加入到兩個(gè)10kDa的超濾膜中，在4℃以3000r/min離心10min，合并下層超濾液后取0.5mL，加入0.5μg(10μL0.05g/L)戊二醛，平行5份，按照2.2.3節(jié)進(jìn)行衍生。另取0.5mL超濾液按照2.2.3節(jié)直接進(jìn)行衍生，平行5份作為空白對(duì)照，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得平均回收率為95.3%。

戊二醛作為交聯(lián)劑直接加入終產(chǎn)品中再次會(huì)引起聚合反應(yīng)，所以上述測定回收率的方法是在超濾液中加入戊二醛進(jìn)行測定，為考慮超濾膜是否對(duì)戊二醛產(chǎn)生吸附，進(jìn)行了下述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，取0.10mg/L戊二醛，(1)同樣品處理方法進(jìn)行處理，然后進(jìn)行色譜分析;(2)直接進(jìn)行衍生后進(jìn)行色譜分析;兩個(gè)實(shí)驗(yàn)各平行10份，對(duì)兩者峰面積平均值在顯著性水平為0.05的情況下進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果兩者無顯著性差異，說明超濾膜對(duì)戊二醛基本無吸附，不會(huì)對(duì)回收率造成影響。

3.5終產(chǎn)品中戊二醛的測定

戊二醛和血紅蛋白的胺基反應(yīng)后生成希夫堿結(jié)構(gòu)，希夫堿經(jīng)過還原后，生成穩(wěn)定的CN單鍵，但是，希夫堿是否能被100%還原還不清楚，如果沒有完全還原，由于生成希夫堿是可逆反應(yīng)，在一段時(shí)間后，沒有被還原的希夫堿會(huì)分解產(chǎn)生戊二醛，可以用本方法測定解離下來的戊二醛。本方法應(yīng)用于終產(chǎn)品中殘余戊二醛的測定，戊二醛濃度低于檢出限

(來源：中國化工儀器網(wǎng))